Assista a uma aula prática de química experimental. Tema: Usando o espectrofotômetro

.::Espectrofotometria de absorção no UV-Visivel (ou Análise colorimétrica por espectrofotômetro)::.

A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria.

.::Fundamentos::.

A luz de uma maneira geral é mais bem descrita como uma radiação eletromagnética em virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela existe e tem um comportamento de campos elétricos e magnéticos oscilantes como a figura abaixo representa:

Onde:

O comprimento de onda (λ) é a distância em metros, de um pico ao outro da onda.

A frequência (v) é o grau de oscilação das ondas em função da velocidade da luz no vácuo, que é representada pela constante c (c=2,998×10⁸m.s^-1). De modo que:

λ . v = c

.::Espectro eletromagnético representando os comprimentos de onda correspondente a cada radiação::.

A técnica espectroscópica é baseada no aumento de energia em função do aumento da frequência da radiação incidida. Quando uma espécie química absorve energia na forma de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma transição de um orbital de mais baixa energia para outro de maior energia.

O aumento de energia é representado pela condição de frequência de Bohr:

E = hv

Onde:

E :  é a energia que aumenta em função da frequência, e

h: é a constante de Planck  h=6,626×10^-34J.s.

A espectrofotometria consiste em usar o espectro radiante para estudar as soluções biológicas e químicas. No procedimento básico, um feixe de energia atravessa a solução, e sua absorção oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos componentes presentes. Para as análises espectrofotométricas, a faixa do espectro de radiação mais utilizada vai do ultravioleta (λ = 200 nm) até o infravermelho (λ = 1000 nm). A faixa do visível vai de 400 a 750 nm, onde os seres humanos experimentam uma gama de sensações visuais denominada cores.

A luz usada em espectrofotometria é chamada luz monocromática, pois é referente a um único comprimento de onda que é obtido através de um espectrofotômetro:

Figura 1: Esquema do Espectrofotômetro: A fonte de luz tem seu feixe focalizado pelo colimador (C) sobre um prisma de quartzo. A luz é decomposta em ultravioleta (UV), violeta (VI), azul (AZ), verde (VE), amarelo (AM), laranja (LA), vermelho (VR) e infravermelho (IV). Ume fenda seletora escolhe uma fina porção desse espectro como luz monocromática (luz MC). A luz MC passa através da cubeta que contém a solução, e parte é absorvida, parte transmitida. Uma fotocélula acoplada a um galvanômetro mede a luz transmitida. A diferença é a luz absorvida. O galvanômetro tem uma escala especial de 0,0 a 2,00, que indica leituras lineares (aritmeticamente proporcionais à absorção da luz). As fontes de luz para ultravioleta são geralmente lâmpadas de Hidrogênio, ou de Deutério. Para o visível e infravermelho, lâmpadas de tungstênio e irradiadores de cerâmica são usados. A decomposição da luz é feita, além de primas, por grades de difração. Um método simples de obter luz MC é usar filtros, que são pedaços de vidro colorido especiais, que deixam passar a luz da sua cor. A luz MC dos filtros é de qualidade inferior à dos primas e grades.

É possível obter comprimentos de onda que sejam específicos para certas substâncias através da construção de uma curva de absorção espectral (varredura); onde a substância em questão (aquela que se quer determinar) é colocada na cubeta, e os comprimentos de onda do UV até o IV vão sendo passados, e a absorção de cada faixa é medida. O comprimento de onda a ser ajustado no aparelho será aquele onde tiver ocorrido a maior absorbância, pois, em essência se trata do pico de absorção de energia pela molécula. Ex: Para a análise do teor de glicose deve-se ajustar o aparelho em 500 nm, pois, se trata da maior absorbância para esta molécula.

Como as moléculas de substâncias diferentes têm níveis moleculares de energia diferentes, ocorre que cada substância absorve a radiação de maneira peculiar. Uma vez conhecido o espectro de absorção de uma substância pode-se determinar também em que quantidade essa substância se apresenta em uma solução analisada. Isso é feito através da medida da intensidade de luz que atravessa a amostra.

Quando a luz incide sobre uma substância pode ocorrer reflexão, refração, espalhamento ou absorção pelo material.

O processo de absorção ocorre a nível molecular. A absorção da radiação se dá quando a energia que ela transporta é igual a diferença entre dois níveis de energia da molécula.

A = log Po/P = log 1/T = – log T

Ex: Ausência de absorção à P = Po à T = 1 à A = 0

90% de luz absorvida à 10% transmitida à P = Po/10 à A = 1

A = ε . b . c

A = absorbância (adimensional)

b = caminho ótico (cm)

c = concentração (mol. L ^-1)

ε = absortividade molar (mol^-1 . L . cm ^-1) à característico de cada substância em cada λ

A lei de Lambert & Beer

A força vital da espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, que estabelece:

“A absorbância é diretamente proporcional a concentração da solução de amostra.”

Ou:

Log(I/I₀) = εcl

A = εcl

Onde:

A: é a absorbância,

ε: é o coeficiente de extinção molar

I: é o comprimento da cubeta

É possível, por simples comparação visual, determinar a concentração aproximada de uma solução colorida comparando-a com soluções do mesmo soluto que tenham concentrações conhecidas. Quando dispomos de aparelhos capazes de medir a intensidade da luz transmitida pelas soluções (fotocolorímetros ou espectrofotômetros) podemos determinar a concentração da solução desconhecida pela aplicação da lei de Lambert & Beer que correlaciona a intensidade da luz transmitida com a concentração do soluto na amostra.

Lei de Lambert – Quando a concentração da substância é constante, a absorção depende do comprimento do trajeto óptico.

Lei de Beer – Quando o trajeto óptico é constante, a absorção depende da concentração.

Combinando as duas leis, Absorção é proporcional ao trajeto óptico e à concentração.

Abs = a.c.l

O que demonstra que a Absorbância (Abs) de uma solução é proporcional (relação linear) à concentração do soluto corado (c).

A partir da proporcionalidade entre absorbância e concentração é possível obter uma curva de calibração, ou seja, um gráfico relacionando a Abs e a Concentração da amostra.

Figura: Curva de Calibração para Método Enzimático (GOD-POD) de detecção de glicose.

R² é chamado de coeficiente de determinação e junto ao coeficiente de correlação R é um indicativo da linearidade do método desenvolvido. Métodos devem ter linearidade alta, ou seja, próximas a 1,0000 para que possam ser utilizados em uma técnica espectrofotométrica.

A equação da reta y=a.x + b permite a relação direta entre a absorbância (y) e a concentração presente na amostra (x). Assim:

Abs = a.[concentração] + b

Para o exemplo acima temos:

Abs = 0,3496.[glicose] – 0,0011

A partir da equação de reta é possível determinar o valor de concentração para qualquer amostra analisada no espectrofotômetro. Exemplo:

Amostra resultou em Abs = 0,356.

Pela equação: 0,356=0,3496x[glicose]-0,0011

0,356+0,0011 = 0,3496x[glicose] (troca de lado, mudando o sinal, para isolar [glicose])

0,3571 = 0,3496 x [glicose]

0,3571/0,3496 = [glicose] (passa dividindo para isolar [glicose])

1,021 mg/mL = [glicose]

.::Passo a Passo para a análise espectrofotométrica::.

1. Ligar o espectrofotômetro e esperar 30 min para aquecimento e estabilização dos circuitos.
2. Ajustar o comprimento de onda (nm).
3. Colocar a estrutura escura (cubeta). Feche a tampa e aperte 0%T (zerar selecionando o T). Escolher o T entre os indicadores A e T. Com isso você calibrou o 0% da Transmitância.
4. Preencha uma das cubetas com água destilada ou o solvente usado puro.
5. Colocar a cubeta com o branco no compartimento de amostras.
6. Ajustar o branco apertando 0A/100%T. Ou dependendo do modelo, apenas zerar selecionando o A.
7. A amostra deve ser preparada com a quebra da mesma por métodos mecânicos, químicos ou físicos.
8. A amostra é solubilizada no solvente escolhido em um balão volumétrico limpo e seco. IMPORTANTE: o solvente na maioria das vezes é água destilada, porém, quando tratar-se de amostras apolares que precisam ser diluídas em solventes orgânicos NUNCA utilize alcenos, alcinos, cetonas ou qualquer outro que tenha ligações C=C ou C=O ou ligações triplas!!!
9. A amostra deve ser filtrada em uma membrana de 0,2 µm, por que a solução deve estar totalmente límpida a fim de diminuir ao máximo o erro causado por partículas em suspensão. A cubeta contendo o branco é retirada do equipamento e sua absorção anotada. Após esse processo a solução de interesse é lida, e dessa absorbância é subtraído a leitura do branco.

.::IMPORTANTE::.

• É imprescindível que o equipamento seja calibrado e manuseado de acordo com as instruções do fabricante, que especifica a margem de erro que o aparelho tem.
• Para evitar erros de leitura sempre certificar-se de que o equipamento esteja fechado. Antes da leitura, a luz do ambiente pode interferir no resultado.
• Manter o equipamento sempre limpo e fechado a fim de evitar o acúmulo de partículas de poeira que interferem na análise. Em hipótese alguma toque a cubeta com as mãos sem luvas, pois nossas mãos contêm gordura que interfere na leitura.
• Somente podem ser analisados por espectrofotometria de absorção compostos que absorvem luz.
• Em caso de soluções fortemente coloridas, como permanganatos, complexos altamente coloridos, dicromatos, cromatos e outros compostos com cores altamente acentuadas deverão ser feitas no mínimo 5 diluições de concentração conhecida e lidas no espectrofotômetro e uma curva analítica deverá ser traçada afim de determinar o coeficiente de extinção molar. Soluções muito concentradas tendem a provocar erros de leitura porque existem muitas moléculas próximas umas das outras.

.::Como criar uma curva de calibração ABS no Excel::.

• Abra o Excel e escolha uma planilha em branco.
• Usando os dados coletados nas leituras no espectrofotômetro crie uma tabela com os valores de concentração à esquerda e ABS (absorbância) à direita como no exemplo abaixo:

• Clique na aba inserir

• Selecione na tabela somente os valores como na figura abaixo:

• Selecione nos tipos de gráficos Dispersão:

• Em Dispersão selecionar a opção com linhas suaves e marcadores – Comparar pares de valores que representam uma função. Também pode ser encontrado como Dispersão – f(x).

• O gráfico será montado automaticamente. Após isso vá em Layout do gráfico e clique nas setas até encontrar um modelo fx. Clique nele.

• O resultado será esse. Aparecerá a equação da reta.

Espero ter ajudado!

Fontes:

• Apostila de Espectrofotômetro – Prof. Luis Carlos Neves
• Prática Laboratorial dirigida pelo Prof. Luis Carlos Neves